では実際にどのように抗体に標識物質を結合させるのでしょうか？
標識の方法は、標識物質を抗体のどこに結合させるかで大きく２つに分けられます。「抗体のアミノ基（NH₂基）につけるタイプ（NH₂タイプ）」と「抗体のチオール基（SH基）につけるタイプ（SHタイプ）」です。それぞれ異なる利点と欠点をもち、低分子の標識物質にはNH₂タイプ、高分子の標識物質にはSHタイプが適しています。

抗体のアミノ基（NH₂基）に標識をつける方法です。
側鎖にアミノ基を持つアミノ酸は4種類（グルタミン、リシン、アルギニン、アスパラギン）ありますが、その中でも標識をつけることができるのはリシンのみです。さらにペプチド結合を形成しないN末端にあるアミノ基にも標識をつけることができます。そのため、この方法では修飾できる場所が右図のようにたくさんあります。

また、操作も下図に示すように簡単です。
活性エステルがついた蛍光物質や酵素を抗体と一緒にインキュベートし、抗体に標識を結合させます。活性エステルが付いた蛍光物質や酵素は数多く市販されていますので、簡単に入手できます。

利点
・簡単です。市販キットも多数あります。
・FITCやBiotinなどの低分子はたくさん結合できるので、感度をあげることができます。

欠点
・標識しすぎると抗体活性に影響が出ます。
・特に、酵素やPEなどの高分子は立体障害を起こし、抗体活性を変質させることがあります。

抗体のSH基をもつアミノ酸（システイン）に標識をつける方法です（マレイミド法）。
標識できる場所は限定的で、ほとんどがヒンジ部位です。　
可変領域（抗原結合部位）におけるシステインの出現頻度は低いです。

抗体を2-メルカプトエタノール（2-ME）で還元し、ヒンジ部位を切断します。還元した抗体（還元抗体）のSH基に蛍光物質もしくは酵素がついたマレイミド基を結合させます。

利点
・酵素やPEなどの高分子を標識する場合でも、抗体の抗原認識部位に対して立体障害を起こすことがありません。

欠点
・多数の蛍光物質や酵素を標識できません。

一次抗体に直接蛍光色素や酵素を標識して使用します。直接標識された一次抗体を用いると実験時間の短縮につながります。

蛍光物質や酵素を標識した二次抗体を使用して一次抗体を検出します。

一次抗体をビオチン化し、標識したアビジンで検出します（ビオチン-アビジン複合体）。