ウエスタンブロッティング（Western Blotting:WB）は、SDS-PAGEを行った後、タンパク質を疎水性膜（メンブレン）に転写し、抗体を用いて特定のタンパク質を検出する方法です。

【WB 作業の流れ】
目的タンパク質に対する抗体の入手 ➡ SDS-PAGE ➡ メンブレンへの転写 ➡ ブロッキングと抗体反応 ➡ バンドの検出

SDS-PAGE後のゲルにメンブレンを密着させ、分離したタンパク質を電圧をかけてゲルからメンブレンに移します。タンパク質を移動させたメンブレンに、一次抗体（目的とするタンパク質に対する抗体）を反応させ、洗浄後、HRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）などの酵素で標識した二次抗体を反応させると、酵素活性を利用した化学発光法もしくは発色法により検出することができます。

SDS-PAGEで分離させたタンパク質をポリアクリルアミドゲルからメンブレンに専用の装置（ブロッティング装置）を使って移動させることを「転写」といいます。

よく使われるメンブレンにはニトロセルロースメンブレンとPVDFメンブレンがあります。

■ PVDFメンブレン：破れにくくタンパク質との吸着力が強いので、CBB染色、一部のアルカリホスファターゼでの検出、リプローブ^※を行う場合に適しています。やや高価です。

■ ニトロセルロースメンブレン：PVDFメンブレンに比べると破れやすいですが、安価でブロッティング前にメタノールによる親水処理を必要とせず、非特異的反応が少ないという利点があります。

※リプローブ：一度検出した後に抗体をはがして、再度別の抗体と反応させて検出すること。

転写の際に使用するバッファーにはいくつか種類があり、タンパク質の分子量や性質の違いにより使用する転写バッファーを変えます。ここでは一般的に使用される転写バッファーを紹介します。

■ 一般的な転写バッファーの組成

タンパク質を転写したメンブレンは抗体との非特異的吸着を防ぐため、ブロッキング処理をします。
ブロッキング処理で抑えられるのはあくまで非特異的な反応のみで、交差反応（目的のタンパク質のエピトープと同じエピトープがある他のタンパク質に抗体が特異的に結合してしまう反応）を防ぐことはできません。
ブロッキングには様々な溶液が用いられますが、以下に一般的なブロッキング溶液を示します。

■ 1~3% BSA in PBS-T^※
BSA（Bovine Serum Albumin；ウシ血清アルブミン）を用います。

■ 1~5%スキムミルク in PBS-T^※
ブロックがより強力で、よく用いられますが、特異的な抗原抗体反応まで抑えてしまう可能性があります。
特にスキムミルクにはリン酸化タンパク質のカゼインが含まれるため、リン酸化タンパク質の検出には不向きです。

※ PBS-T（PBS-Tween 20）
Tween 20を0.05％加えたリン酸緩衝整理食塩水（PBS：Phosphate buffered saline）です。

ブロッキングが終わったら一次抗体、HRP標識二次抗体と反応させます。
このときの一次抗体の濃度は重要で、濃度が低すぎると目的のタンパク質が検出できず、濃度が高すぎると非特異反応が起こり関係のないタンパク質が検出されてしまいます。

■ 一次抗体の至適濃度の検討
初めて使う抗体は、使用文献やデータシートに記載の推奨濃度を参考にして濃度を検討します。
良い結果が得られなければ一次抗体の希釈率を何段階か変える、あるいは希釈液の種類を検討します。

■ 二次抗体
市販のHRP標識抗体もしくはAP（アルカリフォスファターゼ）標識抗体を使う場合もあります。
一次抗体の動物種およびアイソタイプを確認し、間違った二次抗体を使わないように注意します。

メンブレンに基質を含む反応液をかけて、抗体に標識された酵素が触媒する化学反応によって基質が発光した光を冷却CCDカメラもしくはX線フィルムで検出します。

発色試薬を用いて行います。一般的に、HRPを用いるときはDAB（diaminobenzidine）とTMB、AP（アルカリフォスファターゼ）を用いるときはBCIP/NBTを用います。

>> 抗体の標識