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CD8抗体クローンによる染色性の違い



ヒトCD8抗体クローン

クローンT8とクローンSK1, B9.11との比較

HLA-A*24:02陽性健常人末梢血より分離したPBMCを、HLA-A*24:02 EBV BRLF1 Tetramer-PE(Code No. TS-M002-1)もしくはHLA-A*24:02 Negative Tetramer-PE(Code No. TS-M007-1)と、Human CD8抗体の3種類のクローン(T8, SK1, B9.11)を用いて同時染色しました。
その結果、クローンT8では特異的CTLがスポットで検出されましたが、SK1とB9.11ではばらつきが大きくなる傾向がありました。

<参考文献>
Rita C. et al., Int. Immunol. 14: 39−44(2002)

クローンHit8aとクローンT8との比較

T-Select HLA-A*24:02 modified WT1 Tetramer-CYTWNQMNL-PE(Code No. TS-M014-1)とネガティブテトラマー(HLA-A*24:02 Control Tetramer-AYAAAAAAL-PE, Code No. TS-M153-1)と、抗CD8抗体(クローンHit8a, T8)またはIsotype controlを用いて共染色しました。クローンHit8aもT8と同様に、分離能良くCD8陽性かつMHCテトラマー陽性細胞を検出することができました。





マウスCD8抗体クローン

マウスCD8抗体のクローンによるH-2Kb OVA Tetramerの染色性の違い(OT-I mouseの場合)

OT-Iマウス脾臓細胞を、H-2Kb OVA Tetramer-PE(10 μL/sample)と段階希釈したMouse CD8抗体(クローン KT15もしくはクローン53.6.7)で染色して解析を行いました(反応系:1×106 cells/sample, total 100 μL/sample)。Negative Tetramerとして、 H-2Kb β-galactosidase Tetramer-PE(10 μL/sample)を使用して非特異的な反応を調べました。その結果、53.6.7を用いた場合はOT-Iマウス脾臓細胞中のCD8陽性細胞はOVA Tetramerでもβ-galactosidase Tetramerでも染色されました(図2)。53.6.7を希釈して使用しても、同じく両方のテトラマーで染色されました。
KT15を用いた場合、OT-Iマウス脾臓細胞中のCD8陽性細胞はOVA Tetramerでのみ特異的に染色されましたが、KT15を10 μL/sampleで使用した場合は明らかにOVA Tetramer-PEの蛍光強度が低下していました(図1)。濃度検討の結果、KT15を0.63 μL/sampleで使用した場合に、OVA テトラマー陽性細胞集団の蛍光強度が比較的高くなりました。これ以上希釈して使用した場合、更にKT15-FITC陽性細胞集団の蛍光強度が低下してしまいました。ただし、ペプチド免疫してOVA特異的CTLを誘導したマウス脾臓細胞をサンプルとして用いた場合は、KT15を10 μL/sampleで使用しても特に問題は見られませんでした(次項目参照)。
以上より、トランスジェニックマウスであるOT-Iマウス由来の細胞をサンプルとして用いる場合は、Mouse CD8抗体にはクローンKT15を適量で用いること、また、Negative Tetramerを必ず比較対照として置くことが重要であることが分かりました。

  • 図1:Anti-Mouse CD8(KT15)-FITC/Tetramer-PEによる染色
  • 図2:Anti-Mouse CD8(53.6.7)-FITC/Tetramer-PEによる染色

※本検討に使用した濃度はあくまでご使用の目安です。
実験系により、必要に応じて濃度検討を行うことをおすすめします。



マウスCD8抗体のクローンによるH-2Kb OVA Tetramerの染色性の違い
(ペプチド免疫C57BL/6マウスの場合)

ペプチド免疫して特異的CTLを誘導したマウス脾臓細胞を、H-2Kb OVA Tetramer-PE(10 μL/sample)とMouse CD8抗体(クローン KT15もしくはクローン53.6.7)で染色して解析を行いました。Negative Tetramerとして、H-2Kb β-galactosidase Tetramer-PE(10 μL/sample)を使用して非特異的な反応を調べました。その結果、KT15を使用した場合はNegative Tetramerと比較してテトラマー陽性細胞が認められましたが、53.6.7を使用した場合はH-2Kb OVA Tetramer-PE、H-2Kb β-galactosidase Tetramer-PE共に激しい非特異染色が見られました。53.6.7は、H-2Kb OVA Tetramer-PEとは特に相性が悪いことが知られています。OVA Tetramerに限らず、ご使用の際は注意が必要です。MBLでは可能な限りKT15のご使用をお勧めしております。