マウス胆管オルガノイド培養方法

概要

マウス胆管のオルガノイド培養方法について、肝臓組織処理からオルガノイド培養までをご説明します。

方法：肝臓組織酵素処理～オルガノイド培養

手順
①肝臓組織（1 g程度）をPBSにて3回洗浄する。
②洗浄した組織を氷上のシャーレに置き、滅菌済み鋏でおおよそ1 mm角になるまでミンスする。
③ミンスした組織片を50 mLチューブに回収する。
④組織分散液（10 mL）を加え懸濁する。
⑤組織分散液を加えた50 mLチューブを37°Cで30分振とうする。
⑥30分後に組織片が分散されていることを確認する。
⑦30 mLのBasal mediumを加えて、セルストレーナー（メッシュサイズ：100 µm）を50 mLチューブにセットし、組織懸濁液を通す。
⑧遠心（400 g × 3分、室温）し、上清を除去する。
⑨30 mLのBasal mediumを加えて、ペレットを懸濁する。
⑩遠心（400 g × 3分、室温）し、上清を除去する。
⑪1 mLのBasal mediumを加えて懸濁する。
⑫一部を採取し、同量のTrypan Blue Solutionと混和して細胞を染色し、生細胞数をカウントする。
⑬48-well plateの1ウェルに2,000 - 5,000 cells播種するため、播種するウェル分の細胞を⑪から1.5 mLチューブに採取し、氷上におく。
⑭⑬の細胞懸濁液にMatrigel®を加えて細胞密度を100,000 - 250,000 cells/mL（2,000 - 5,000 cells/20 µL）に調製する。
⑮48-well plateに20 µLずつ播種してドームをつくる。
⑯37°Cインキュベーターで10～15分ほど加温してゲル化させる。
⑰250 µL/ウェルのOrganoid Growth Mediumを添加してインキュベーターで培養する。
⑱2-3日毎にOrganoid Growth Mediumで培地交換を行う。

※継代、凍結ストックの作製、起眠はヒト腸オルガノイド培養工程をご覧ください

マウス胆管オルガノイドの樹立例

上記プロトコルのとおり、マウス肝組織から調製した細胞懸濁液にMatrigel^®を加え細胞密度2,000 cells/20 µLとなるように調製、プレートに播種し培養した結果、オルガノイドの形成が確認できた。

その他の培養工程

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• ヒト腸オルガノイドの樹立
• ヒト腸オルガノイドの継代（酵素分散法）
• ヒト腸オルガノイドの凍結ストック作製
• ヒト腸オルガノイドの凍結ストックの起眠