Afamin/Wnt3a CM

無血清培地における安定的なオルガノイド培養の実現に！

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特長

• 安定したWnt3a活性
• 無血清培地によるオルガノイド培養が可能
• オルガノイドの長期培養の実現

Wntタンパク質の重要性

Wntシグナルは初期発生や幹細胞の維持と再生、がん化に関与していることが知られており、これらの増殖・維持に重要な役割を果たしています。特にWnt3aは腸管上皮細胞におけるLgr5陽性幹細胞の増殖維持に必須のニッチ成分であることが明らかとなり、小腸、大腸、胃、膵臓、肝臓など様々な消化管オルガノイドの作製に使用されています。

Afamin/Wnt3aについて

Wnt3aは、従来より消化管オルガノイドの培養に利用されていましたが、脂溶性タンパク質であるため無血清培養液中で凝集体を形成し、十分に活性を発揮できないことが課題でした。
Miharaらは、血清の構成成分の一つであるAfaminがWnt3aと複合体を形成することにより、高いWnt3a活性が維持できることを見出しました（PMID: 26902720）。また、 AfaminとWnt3aの複合体をオルガノイドの培養に使用することにより、オルガノイドの長期培養が可能となりました。

Afamin/Wnt3aコンプレックスの概要図

Afamin/Wnt3aコンプレックスの安定性

試験データ

Afamin/Wnt3a CMを用いた消化管オルガノイドの長期培養

Wnt3a CM（Wnt3a単独発現培地）、Wnt3a精製品及びAfamin/Wnt3a CM（Afamin/Wnt3a共発現培地）存在下で消化管オルガノイドを長期培養しました。

Afamin/Wnt3a CM存在下では、18日間の長期培養でもオルガノイドが維持できました。

Afamin/Wnt3a CMによるLGR5陽性細胞の維持培養

Afamin/Wnt3a CM及び他社製品の組換えWnt3a存在下で、Lgr5プロモーターの制御下にtdTomatoを発現するオルガノイド株を培養しました。Afamin/Wnt3a CM存在下での培養では、高いレベルでLGR5陽性細胞を維持していることが確認できました。

肺オルガノイドの樹立・維持におけるAfamin/Wnt3a CMの影響

データ提供：大阪大学大学院 医学研究科 病態病理学講座 高島剛志様

肺胞上皮細胞の増殖にはEGF, FGF, Wnt3aをはじめとする様々な成長因子が必要とされています。今回、ヒトⅡ型肺胞上皮オルガノイドを用いてAfamin/Wnt3a CM添加時における形態学的評価、増殖能、肺胞上皮細胞細胞マーカーの発現量の定量を行いました。

肺胞上皮オルガノイドの樹立

Afamin/Wnt3a CM使用文献（PMID: 34038715）に従いヒトII型肺胞上皮オルガノイドを樹立した結果、樹立効率はほぼ100％でした。（培養液中のニッチ因子に関しては文献の組成に軽微な変更を加えています。）

Afamin/Wnt3a添加時における形態学的評価

上記で樹立した肺胞上皮オルガノイドをⅡ型肺胞上皮細胞マーカーSFTPC（中央）、HTⅡ-280（右）で染色しました。その結果、肺胞上皮オルガノイド中にSFTPC陽性細胞、HTⅡ-280陽性細胞が存在していることが確認できました。

Afamin/Wnt3aの有無における増殖能の検討

Afamin/Wnt3a CMを添加した培地と、添加しなかった培地で肺胞上皮オルガノイドの増殖能を調べた結果、Afamin/Wnt3a CMを添加した培地において肺胞上皮オルガノイドの増殖能がより高いことを確認できました。

Afamin/Wnt3a添加におけるⅡ型肺胞上皮細胞マーカー発現量の検討

Afamin/Wnt3a CM添加培地で培養した肺胞オルガノイドは、qRT-PCRにおいてSFTPC発現がより高いことを確認できました。

以上よりⅡ型肺胞上皮オルガノイドの維持にAfamin/Wnt3aが必要であると考えられます。

Stat3遺伝子欠損マウス小腸オルガノイドに対するAfamin/Wnt3a CMの作用

データ提供：金沢大学 がん進展制御研究所 腫瘍遺伝学研究分野 大島浩子先生

Stat3遺伝子欠損マウス小腸クリプト細胞は、Wntリガンドを含む通常の培地（R-Spondin 1など）では、オルガノイド形成効率が著しく低下することを見出しています。一方で、Rock阻害薬Y-27362、およびWntシグナル亢進作用のあるGSK3阻害薬CHIR-99021存在下では、オルガノイド形成効率の部分的な回復が認められます。そこで、Stat3遺伝子欠損細胞由来オルガノイドの生存・増殖におけるWntシグナルの作用について検討するためにAfamin/Wnt3a CMを使用しました。

Afamin/Wnt3aの野生型マウス小腸クリプト由来オルガノイドへの作用

通常使用している正常クリプトのオルガノイド用培地（control CM）よりも、Afamin/Wnt3aを含む培地の方が、小腸クリプト由来オルガノイドの成長を亢進しました。

Stat3遺伝子欠損マウス小腸クリプトオルガノイドへのAfamin/Wnt3aの作用

Stat3欠損小腸細胞は、通常のオルガノイド用培地（CM）では、ほとんど生存・増殖できませんが、Afamin/Wnt3aを含む培地では、RockおよびGSK3阻害薬非添加条件においても増殖し、オルガノイドを形成することを確認しました。

以上より、Afamin/Wnt3a CMはＷntシグナルを活性化し、Stat3欠損マウス小腸クリプトオルガノイドの生存・増殖に効果的であると示されました。

Afamin/Wnt3aを用いた原発性卵巣がん組織検体からのオルガノイドの樹立及び株化

Afamin/Wnt3a CM及び競合他社のRecombinant Wnt3a存在下で、原発性卵巣がん組織検体からオルガノイドの樹立を行いました。
Wnt依存性のがん組織において、Afamin/Wnt3a CM存在下ではオルガノイド培養成功率及びオルガノイドの株化数増加が確認できました。

	検体数	初代培養成功数（培養成功率）	オルガノイド株化成功数
Afamin/Wnt3a CM	23	17（74%）	9
競合他社製 Recombinant Wnt3a	13	6（46%）	0

*高異型漿液性癌を除いた結果

Wntタンパク質の活性強度は初代培養や、オルガノイド樹立の成功率を左右するものであり、Afamin/Wnt3aは、競合他社品のWnt3aと比較してWntアゴニスト活性が安定して高いため、表のように初代培養および株化の効率が上がるものと考えられます。

卵巣がん組織とオルガノイドの染色像

Afamin/Wnt3a CM存在下で樹立したオルガノイドは、組織検体と同様の組織学的な特徴及びp53陽性パターンを反映していました。

Wnt3a試薬の比較

	Afamin/Wnt3a CM	Purified Wnt3a	Wnt3a conditioned medium prepared in lab
Wnt3a活性	Afaminによって安定化された 高いWnt3a活性	培養液中で凝集体を形成するため 不十分なWnt3a活性	血清で安定化された 高いWnt3a活性
品質評価	Wnt3aシグナル活性評価	多くはタンパク質定量 Wnt3a活性にLot間差がある場合もある	各研究室で調製されており、 発現量・活性ともに未確認
血清の有無	無血清	無血清	血清入り 血清由来成分がオルガノイド培養に 影響を与える恐れあり

製品仕様

Afamin/Wnt3a CMはAfaminとWnt3aタンパク質を無血清培地中に共発現させたConditioned Mediumであり、無血清培地中で高いWnt3a活性が期待できます。

Code No.	品名	主要成分	包装形態	溶媒	保存期間
J2-001	Afamin/Wnt3a CM	Mouse Wnt3a Human Afamin	10 mL	Advanced D-MEM/F-12	ラベルに記載

関連製品

Recombinant Afamin/Wnt3a

Recombinant Afamin/Wnt3aは、Afamin/Wnt3a複合体の精製品です。

Code No.	品名	主要成分	包装形態	溶媒	保存期間
J2-002	Recombinant Afamin/Wnt3a	Mouse Wnt3a Human Afamin	60 µg/300 µL	20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl	ラベルに記載

本製品の使用に際して

オルガノイド等の培養において、本製品を他の因子との組合せで使用する場合、当該他の因子の使用等に第三者の特許が存在する可能性がございます。本製品は、他の因子との組合せによる使用等まで保証するものではございませんので、当該他の因子との組合せで使用する場合に関しては、ご所属の知財部・調査機関へご確認のうえ、本製品をご利用ください。

カタログ情報

参考文献

Afamin/Wnt3aの開発文献

Afamin/Wnt3aの使用文献