ヒト腸オルガノイド培養方法

1. ヒト腸オルガノイドの樹立

手順
①ヒト腸上皮細胞を37°C湯浴で融解する。
②15 mLチューブにBasal mediumを10 mL入れて、①を添加する。
③遠心（400 g × 3分、室温）する。
④培地上清を除去する（細胞がペレットとなっていることを確認してから行う）。
⑤遠心（400 g × 3分、室温）する。
⑥残った培地をピペットマンで除去する（細胞を吸ってないことを確認する）。
⑦1 mLのBasal mediumを加えて懸濁する。
⑧一部を採取し、同量のTrypan Blue Solutionと混和して細胞を染色し、生細胞数をカウントする。
⑨24-well plateの1ウェルに10,000-60,000 cells播種するため、播種するウェル分の細胞を⑦から1.5 mLチューブに採取し、氷上におく。
⑩⑨の細胞懸濁液にMatrigel®を加えて細胞密度を200,000-1,200,000 cells/mL（10,000-60,000 cells/50 µL）に調製する。 （Matrige®が70％以下に希釈される場合は、⑦の細胞懸濁液を遠心して、⑥から再度細胞調製を行う。） ※Matrigel®はCORNING Incorporatedの登録商標です。
⑪24-well plateに50 µLずつ播種してドームをつくる。
⑫37°Cインキュベーターで10～15分ほど加温してゲル化させる。
⑬500 µL/ウェルのOrganoid Growth Mediumを添加してインキュベーターで培養する（Matrigel®が崩れないように壁を伝わせるようにゆっくり添加する）。
⑭2-3日毎にOrganoid Growth Mediumで培地交換を行う。

ヒト腸上皮細胞からの腸オルガノイドの樹立例

下図は、培養6日目、培養10日目の顕微鏡画像（対物レンズ2倍、Scale bar, 100 µm）
（播種密度：30,000 cells/50 µL）

その他の培養工程

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