ヒト腸オルガノイド培養方法

4. ヒト腸オルガノイドの凍結ストックの起眠

手順
①細胞ストックを37°C湯浴で融解する。
②15 mLチューブにBasal mediumを10 mL入れて、①を添加する（吸着しやすいため低吸着チップ及び低吸着チューブを使用する）。
③遠心（400 g × 3分、室温）する。
④上清を除く（細胞がペレットとなっていることを確認してから行う）。
⑤遠心（400 g × 3分、室温）する。
⑥残った培地をピペットマンで除去する（細胞を吸ってないことを確認する）。
⑦30-50 µLのBasal mediumを加えて懸濁する。
⑧一部を採取し、同量のTrypan Blue Solutionと混和して細胞を染色し、生細胞数をカウントする。
⑨48-well plateの1ウェルに1,000 cells播種するため、播種するウェル分の細胞量を⑦から1.5 mLチューブに採取し、氷上におく。
⑩⑨の細胞懸濁液にMatrigel®を加えて細胞密度を50,000 cells/mL（1,000 cells/20 µL）に調製する。 ※Matrigel®はCORNING Incorporatedの登録商標です。	＜方法 1. ヒト腸オルガノイドの樹立＞の手順⑩の動画をご覧ください。
⑪48-well plateに20 µLずつ播種してドームをつくる。	＜方法 1. ヒト腸オルガノイドの樹立＞の手順⑪の動画をご覧ください。
⑫37°Cインキュベーターで10～15分ほど加温してゲル化させる。
⑬250 µL/ウェルのOrganoid Growth Mediumを添加してインキュベーターで培養する（Matrigel®が崩れないように壁を伝わせるようにゆっくり添加する）。	＜方法 1. ヒト腸オルガノイドの樹立＞の手順⑬の動画をご覧ください。
⑭2-3日毎にOrganoid Growth Mediumにて培地交換を行う。	＜方法 1. ヒト腸オルガノイドの樹立＞の手順⑭の動画をご覧ください。

その他の培養工程

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