Mouse MHC class II Tetramer

MOG_35-55 peptideは、多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎 (experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE) を引き起こすことが知られています。この方法では、MOG_35-55 peptide免疫後早期にEAEの症状が現れること、必要な材料の入手が比較的容易であることから、自己免疫疾患のモデル実験系として広く使用されています。EAEの発症には、regulatory T (Treg) 細胞やTh17細胞などの関与が報告されており、CD4⁺ T細胞の免疫バランスが重要であることが示唆されています。

I-A^b拘束性のMOG_35-55 peptide (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK, Code No. TS-M704-P) 100 nmol を、10 µg のcholera toxin (Code No. RK-01-511) および免疫賦活剤とエマルジョン化してマウスに2回腹腔免疫しました。11日後に脾臓を摘出して脾細胞を調製後、一部をサンプリングしてI-A^b MOG_35-55 Tetramer-PE (Code No. TS-M704-1) を用いて染色しました (day 0)。これらの脾細胞は、in vitro においてMOG_35-55 peptide (10 µg/mL) で6日間刺激培養しました。これを同様にMHC Tetramer試薬を用いて染色しました (day 6)。 その結果、 I-A^b MOG Tetramer特異的なCD4⁺ T細胞を検出することができました。Negative control細胞 (mouse 3) では、 I-A^b MOG Tetramer特異的なCD4⁺ T細胞は検出されませんでした。図中右上の数値はCD4陽性細胞中のテトラマー陽性細胞率（%）を示します。

OVAは、多様な免疫反応を惹起させるモデル抗原として非常に多くの研究分野で利用されています。 I-A^bにOVA_323-339エピトープ （ISQAVHAAHAEINEAGR） が提示された状態を特異的に認識するTCRのトランスジェニックマウス (OT-IIマウス) は、T細胞の分化の過程、活性化などを解析するツールとして免疫学的研究に大きく貢献しています。 I-A^b OVA_323-339 Tetramer (Code No. TS-M710-1) は様々な実験系において重要なツールになることが期待されます。
<参考文献>
1) Barnden MJ, et al., Immunol Cell Biol. 76: 34−40 (1998)
2) Moon JJ, et al., Immunity. 27: 203−213 (2007)
3) Landais E, et al., J Immunol. 183: 7949−7957 (2009)

染色例1：OT-II マウス脾細胞での I-A^b OVA_323-339 Tetramer試薬の反応性

OT-II マウスの脾細胞を用いて、I-A^b OVA_323-339 Tetramer 試薬の反応性を検討したところ、陽性細胞集団が検出される個体（Mouse 2）と染色されない個体（Mouse 1）が存在することが明らかとなりました（A）。
Mouse 1 に関しては、OVA_323-339 特異的TCR の発現レベルが低いと考えられたことから、peptide による特異的刺激により発現レベルを上げることができるかについて検証を行いました。
Mouse 1 の脾細胞に、最終濃度が1 µg/mL になるようにOVA_323-339 peptide（ISQAVHAAHAEINEAGR, Code No. TS-M703-P（販売終了））を加えて、6 日間培養後、MHC Tetramer 試薬の反応性を検討しました（B）。
その結果、Mouse 1 において、in vitro peptide stimulation により特異的T 細胞の誘導が確認できました。
Negative control としてI-A^b MOG_35-55 Tetramer を用いた場合は、陽性細胞は検出されませんでした。

染色例2：OVA_323-339 peptide 免疫マウスでの染色例

100 nmol のOVA_323-339 peptide と、10 µg のcholera toxin (MBL code no. RK-01-511) を免疫賦活剤とエマルジョン化してC57BL/6 マウスに2 回 腹腔免疫しました。
11 日後に脾臓を摘出して脾細胞を調製し、一部をサンプリングしてMHC Tetramer 試薬を用いて染色しました（day 0）。
これらの脾細胞は、in vitro において最終濃度が1 µg/mL になるようにOVA_323-339 peptide を加え、8 日間培養しました(day 8)。これを同様にMHCTetramer 試薬を用いて染色しました。
OVA_323-339 peptide を免疫したマウスにおいて、in vitro　peptide stimulation により特異的T 細胞の誘導が確認できました。Negative control として、I-A^b MOG_35-55 Tetramer を用いた場合は、陽性細胞は検出されませんでした。

ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）はグラム陽性細菌に分類され、肺結核などの結核症の原因菌としてよく知られています。ESAT-6（Early Secreted Antigenic Target 6）は、Mtb が分泌する主要な低分子タンパク質で、強い抗原性を有しています。結核ワクチンに使用されているM. bovis BCG 株ではESAT-6 遺伝子を欠損していることから、この抗原に特異的なT 細胞応答はBCG 接種者における結核感染の診断に利用されています。ESAT-6_1-20 は、I-A^b拘束性の immunodominant なエピトープとして知られており、生体内における免疫応答のモニタリングや新しいワクチン開発の研究などで広く使用されています。I-A^b ESAT-6_1-20 特異的なTCR を持つトランスジェニックマウスも作製されており、I-A^b ESAT-6_1-20 Tetramer (Code No. TS-M707-1) は様々な実験系において重要なツールになることが期待されます。

ヒト型結核菌H37Rv株あるいはBCG Pasteur株を感染させたマウスの肺組織中および脾臓細胞における ESAT-6_1-20 特異的CD4⁺T細胞の染色例

FSC/SSC 展開にてリンパ球領域をR1、CD4 陽性細胞領域をR2 とし、 7-AAD 陰性細胞領域をR3 としました(A)。このR1 かつR2 かつR3 領域にて解析を行ないました。

ヒト型結核菌H37Rv株あるいはBCG Pasteur株を尾静脈よりマウスに感染（5x10⁵ CFU/匹）させ、4週間後に肺および脾臓を摘出して細胞を調製しました。これらの細胞を、MHC Tetramer試薬を用いて染色しました。

その結果、肺に存在するリンパ球において、ヒト型結核菌感染マウスでCD4陽性細胞中7.73%の I-A^b ESAT-6_1-20 Tetramer陽性細胞が検出されました（B）。また、脾臓細胞においてヒト型結核菌感染マウスでのみ、I-A^b ESAT-6_1-20 Tetramer陽性細胞が検出され、BCG感染マウスでは I-A^b ESAT-6_1-20 Tetramer陽性細胞は検出されませんでした（C）。

データ提供：
国立大学法人 京都大学大学院 医学研究科
基礎医学系 感染・免疫学講座 微生物感染症学
酒井 俊祐 先生、光山 正雄 先生
*ご所属はデータ提供時のものです。

I-A^b ESAT-6_1-20 Tetramer の反応温度による染色性の違い

左図はTetramer染色の反応温度を検討したデータです。結核菌感染マウス脾臓細胞を、室温もしくは氷上で1時間反応しました。

その結果、 I-A^b ESAT-6_1-20 Tetramerにおいては室温での反応を行った方が、蛍光強度が強く出ることが分かりました。データには示しておりませんが、同一条件で2時間の反応を行った場合でも、氷上での反応系において、大きく蛍光強度が上がることはありませんでした。

※本データはFSC/SSC展開にてリンパ球領域をR1、 7-AAD陰性細胞領域をR2としました。このR1かつR2領域にて解析を行いました。

データ提供：
国立大学法人 京都大学大学院 医学研究科
基礎医学系 感染・免疫学講座 微生物感染症学
酒井 俊祐 先生、光山 正雄 先生
*ご所属はデータ提供時のものです。

ペプチド免疫による I-A^b ESAT-6_1-20 Tetramer 特異的CTLの誘導

I-A^b ESAT-6_1-20 peptide （MTEQQWNFAGIEAAASAIQG, Code No. TS-M707-P（販売終了））100 nmolを、10 µg のcholera toxin （Code No. RK-01-511）および免疫賦活剤とエマルジョン化してマウスに2回腹腔免疫しました。11日後に脾臓を摘出して脾細胞を調製後、一部をサンプリングしてMHC Tetramer試薬を用いて染色しました（day 0）。これらの脾細胞は、in vitro においてESAT-6_1-20 peptide（0.1 µg/mL）で8日間刺激培養しました。これを同様にMHC Tetramer試薬を用いて染色しました（day 8）。 その結果、 I-A^b ESAT-6_1-20 Tetramer特異的なCD4⁺T細胞を検出することができました。Negative Tetramer (I-A^b MOG_35-55 Tetramer, Code No. TS-M704-1)では、 陽性細胞は検出されませんでした。

※本データはFSC/SSC展開にてリンパ球領域をR1、 7-AAD陰性細胞領域をR2としました。このR1かつR2領域にて解析を行いました。

Anti-Mouse TCR DO11.10 (clone KJ1.26) は、 I-A^d拘束性OVA_323-339特異的TCRを認識する抗体としてよく知られています。OVA_323-339 (ISQAVHAAHAEINEAGR, Code No. TS-M703-P（販売終了）) の配列は、抗原特異的CTLを誘導する際のヘルパーペプチドとしても使用されています。

マウスの主な系統によるI-A アリル

I-A アリル	I-Ab	I-Ad	I-Ak	I-As
Mouse strains	C57BL/-, BXSB/Mp, 129/-	BALB/c, DBA/2	C3H/He	SJL/J, B10.S

OVAは、多様な免疫反応を惹起させるモデル抗原として非常に多くの研究分野で利用されています。
I-A^d OVA_323-339 Tetramerは様々な実験系において重要なツールになることが期待されます。

B10.D2マウスでのOVA_323-339 peptide免疫によるI-A^d OVA Tetramer（Code No. TS-M703-1）の染色例です。
OVA_323-339 peptide（ISQAVHAAHAEINEAGR, Code No. TS-M703-P（販売終了））をB10.D2マウスに腹腔免疫し、29日後に脾臓を摘出して脾細胞を調製しました。調整した脾細胞をin vitro においてOVA_323-339 peptideで刺激して13日間培養後、MHC Tetramer試薬を用いて染色しました（Day13）。　
FSC/SSC展開にてT細胞領域をR1, FSC/7-AAD展開にて生細胞領域をR2として、解析を行っています。ドットブロット展開図右上の数字は、CD4陽性細胞中のMHC Tetramer陽性細胞の割合を示しています。OVA_323-339 peptideを免疫したマウスにおいて、特異的T細胞の誘導が確認できました。Negative controlとして、I-A^b OVA323-339 Tetramerを用いた場合は、陽性細胞は検出されていません。また、I-A^d OVA_323-339 に特異的なTCRクローンDO11.10特異抗体を用いた場合においても、特異的T細胞を検出することができています。

I-A^g7アリルは、インスリン依存型糖尿病モデルであるNOD（nonobese diabetic）マウスにおける自発的なインスリン依存性糖尿病（IDDM）の発症およびBiozzi AB/Hマウスにおける実験的アレルギー性脳脊髄炎の誘発と強く関連していることが知られています。
BDC2.5 mimotopeは、ランダムなペプチドライブラリーより単離されたBDC2.5T細胞のサロゲートリガンドとして知られています。

使用例

【免疫原】
　BDC2.5 mimotopeペプチド（AHHPIWARMDA, Code No. TS-M727-P販売終了））
【動物種及び細胞】
　NODマウス　脾臓由来の細胞（摘出直後）
【コントロール】
　T-Select I-A^g7 human CLIP_103-117 Tetramer-PE（Code No. TS-M717-1）

使用例

【免疫原】
　マウス2W1Sペプチド（EAWGALANWAVDSA, Code No. TS-M722-P（販売終了））
【動物種及び細胞】
　C57BL/6マウス　脾臓由来の細胞
　＜Day 0＞　摘出直後
　＜Day 6＞　摘出した細胞にマウス2W1Sペプチドを添加し、6日間培養
【コントロール】
　T-Select I-A^b human CLIP_103-117 Tetramer-PE（Code No. TS-M715-1）

テクニカルヒント