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IMMUNOCYTO Cytotoxicity Detection Kit



安全・確実に細胞傷害性活性を測定!

ウィルス感染細胞や腫瘍細胞などの細胞(Target細胞)は、細胞傷害性活性を持つT細胞やNK細胞(Effector細胞)により直接認識され、傷害が起こります。細胞傷害性活性を測定する方法として、51Cr遊離試験(クロムリリースアッセイ)や傷害を受けた細胞から放出される細胞質酵素の活性(GOT、GPT、LDH)を測定する方法などが知られています。
IMMUNOCYTO Cytotoxicity Detection Kit(Code no. AM-1005Mは、Target細胞をCFSEとKusabira-Orange標識Annexin Vで二重染色し、フローサトメトリーによって細胞傷害性活性を測定する試薬です。CFSE染色されたTarget細胞のうち、Annexin V染色された細胞の割合、つまり死細胞の割合で、Effector細胞の細胞傷害性活性を測定します。フローサイトメトリーで細胞を分離するので、Effector細胞により誘導された死細胞を確実に分離し測定することができます。


Annexin Vによるアポトーシス検出の原理

VIB domain 脂質二重層の内側に存在しているphosphatidylserine(PS)は、アポトーシスをおこした細胞では、膜構造の変化により細胞表面に露出します(右図)。Annexin VはCa2+存在下でPSに対して強い親和性をもつため、アポトーシス細胞に結合します。 蛍光標識したAnnexin Vを用いる事で、Effector細胞により傷害されたTarget細胞をフローサイトメトリーにて検出することができます。IMMUNOCYTO Cytotoxicity Detection Kitには、蛍光蛋白質Kusabira-Orange(KO; Excitation Max 548 nm/Emission Max 559 nm)標識したAnnexin Vが含まれています。

フローサイトメトリーによるデータ解析

VIB domain 右図は、IMMUNOCYTO Cytotoxicity Detection Kitを用いて細胞傷害性活性を解析したデータです。Effector細胞(E)、Target細胞(T)は図の下に示した通りです。
Killingが起こると、CFSE陽性であるTarget細胞がAnnexin V陽性になることが分かります。この数値(%)を用いて、細胞傷害性活性を下記の式を用いて数値化することができます。

 Cytotoxicity(%)=[(ET-T0)/(100-T0)]×100
  ET: Effector細胞とTarget細胞を共培養したときの、CFSE+ Annexin V+ 細胞の割合(%)
  T0: Target細胞のみを培養したときの、CFSE+ Annexin V+ 細胞の割合(%)



細胞傷害性活性を示すグラフ

VIB domain HLA-A*24:02 CMV pp65 CTL line による細胞傷害性活性のグラフ2 例を右に示します。
データは、上に記載した解析方法で解析しました。

VIB domain <上グラフ>
Effector cells: HLA-A*24:02 CMV pp65 CTL line
Target cells: OKT3刺激で非特異的に増殖させたHLA-A*24:02 auto PBMC line

<下グラフ>
Effector cells: HLA-A*24:02 CMV pp65 CTL line
Target cells: 図中に示す各alleleのLCL
( )内はパルスしたpeptideの種類