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RiboTrap Kit

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  1. RiboTrapとは何ですか?
    興味のあるRNAを「bait:餌」として、RNA結合タンパク質を分離する手法です。 既知のタンパク質だけでなく、これまで報告されていないタンパク質を分離できる可能性があります。
  2. RiboTrapとEMSA(ゲルシフトアッセイ)の違いは何ですか?
    RiboTrapは、特定のRNAと結合するタンパク質の探索を目的とした手法です。既知のRNA結合タンパク質(RBP)だけでなく、これまで報告されていないRBPを同定できる可能性があります。 一方のEMSAは、特定の塩基配列を持つ核酸とタンパク質の結合を調べる手法です。
  3. BrU標識RNAの合成はどのように行いますか?
    弊社では、in vitro transcriptionの反応基質に、一定量の比でBrUTPを加えることで、BrU標識RNAを合成しています。 BrUTPとUTP のモル比は 1:1~1:3を推奨しています。モル比の最適化ではRNA配列中のウラシル含有量を考慮してください。
  4. BrUTPはどの程度取り込まれるのですか?
    BrUTPが取りこまれる割合はRNAの配列中のウラシル含有量およびBrUTPを加える比率に依存します。さらに、in vitro transcriptionではBrUTPはRNAにランダムに取り込まれます。特定の部位にBrU標識したい場合は、合成オリゴの使用をおすすめします。
  5. BrU標識がRNAとタンパク質の結合を阻害することはありませんか?
    社内で検討した限りでは可能性は低いと考えています。
  6. small ncRNAに結合するタンパク質を調べることはできますか?
    短いRNAでRiboTrapを行う場合、目的配列中のどの部位が何か所BrU標識されるか考慮する必要があります。任意の位置に決まった数のBrUを標識したい場合は、bait にはRNAオリゴの使用をおすすめします。
  7. in vitro transcriptionで取り込まれなかったBrUTPによって、抗体とBrU-RNAとの結合が阻害される可能性はありますか?
    in vitro transcriptionで取り込まれなかったBrUTPは、抗体との結合を競合的に阻害します。したがって、in vitro transcriptionの後にBrU-RNAの精製を行ってください。
  8. BrU取り込み後の確認はしていますか?
    弊社では、次の図で示す方法により確認しています。
  9. RiboTrap Kitを使って実験を始める際に必要なタンパク質量はどのくらいですか?
    タンパク質量で揃えてはおりませんが、細胞数で7-10×107個程度から実験を始めています。
  10. 3種類ある洗浄bufferの違いは何ですか?
    ・ Wash Buffer I:3種類の中でもっともマイルドな組成のため、強い結合のタンパク質だけでなく弱い結合のタンパク質を落とすことができます。その反面、バックグラウンドも多少増えます。
    ・ Wash Buffer II:イオン強度が強いため、RNAと強く結合するタンパク質を優位に得ることができます。
    ・ Wash Buffer III:強いdetergentのため、間接的に結合するタンパク質を減らします。
    実験の目的に応じて選択してください。
  11. 非特異的結合を減らすためにtRNAを添加したいのですが、検討したことはありますか?
    tRNAでのブロッキングは未検討です。RiboTrap Kit構成品のWash Bufferを用いた洗浄により、非特異結合はある程度回避できる結果が得られています。洗浄条件の検討では、まずWash Buffer Iを使用していただき、必要に応じてWash Buffer IIまたはWash Buffer IIIをご使用ください。
  12. RiboTrap Kitで、BrU標識RNAとCell Lysateを混合する際に、RNAが分解してしまいませんか?
    Lysate調製のバッファーにはRNase inhibitorを添加しています。 また、RiboTrapに限らず、RIP-assayにおいてもNuclease-freeのグレードの試薬や器具を使用する、マスクと手袋を着用する、温度管理の徹底など、極力RNAの分解が起こらないように注意してください。
  13. RiboTrap Kitを使用するうえで、推奨するin vitro転写キットはありますか?
    RiboTrap Kitで使用可能なキットは以下をおすすめしています。
    ・ CUGA®7 in vitro Transcription Kit(Nippon Gene; code. 307-13531)
    ・ Riboprobe® System-T7 (Promega; code. P1440)
    ・ TranscriptAidTM T7 High Yield Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific; code. K0441)
  14. RiboTrap Kitを使用するうえで、推奨するビーズはありますか?
    Immobilized Protein G Plus (Pierce; code. 22852) をおすすめしています。その他、Dynabeads® (Invitrogen; code. 10003D)やProtein G-Magnetic Beads (MBL; code. MJS002V2)も、使用できます。
  15. Xistのような長いRNAはRiboTrapに使用できますか?
    弊社では経験がありません。しかし、何種類かtruncated formを作製してbait とすることでRiboTrap可能となります。
  16. タンパク質だけでなくmiRNAも回収したいのですが、可能ですか?
    miRNAの回収も可能です。抗体反応(抗体-bait RNA-RNP複合体形成)および洗浄後、RIP-Assay Kit for microRNAのRNA抽出プロトコールのSeparation法でmiRNAを回収し、その後、クローニング、シークエンスと進めた経験があります。目的のRNAによりますが、RISC構成タンパク質に対する抗体でRIP-Assayを行う場合と異なり、回収されるmiRNAは少ないことが予想されます。したがって、タンパク質とmiRNA両方回収したい場合は、スタート量を増やして実験することをおすすめします。