DDDDK融合タンパク質精製ゲル～実践編～

DDDDK融合タンパク質精製ゲルは繰り返しの使用にも、還元条件・酸性条件にも強い精製ゲルです！グリセロール不含なので、扱いやすいと好評です！
他社製品との性能比較
10回再利用テスト（非還元条件下）
10回再利用テスト（還元条件下）
pH3.0耐性テスト

DDDDK-tagged PROTEIN PURIFICATION GEL（Code No.3328）とA社精製ゲルを用いて、DDDDK-tagのついた2種類のタンパク質をバッチ法により精製しました。

DDDDKタグ融合タンパク質精製量・カラムへの残存量比較

ペプチド溶出後のDDDDK融合タンパク質量と、溶出後のビーズに残ったタンパク質量をゲル電気泳動およびクマシー染色を行い比較しました。

実験条件

ゲル： DDDDK-tagged PROTEIN PURIFICATION GEL（Code No.3328）、A社ゲルを各5 μL（ゲル容量）使用
精製前サンプル：RPMI/ 10% FCS 0.5 mL+ 5 mg DDDDK-GFP
　　　　　　　　RPMI/ 10% FCS 0.5 mL+ 5 mg DDDDK-BAP
精製前サンプルとゲルの反応時間：4°C 1時間
溶出：DDDDK-tag peptide（Code No.3325-205）20 μL×2回
泳動サンプル：ペプチド溶出サンプル40 μL中、20 μL泳動したもの（サンプル）
　　　　　　　溶出後のゲルにSDS-PAGEバッファー20 μLを加え煮沸し、20 μL泳動したもの（ゲルへの残存）

DDDDKタグ融合GFPタンパク質の精製

DDDDK-tagged PROTEIN PURIFICATION GEL（Code No.3328）とA社精製ゲルを用いて、3種類のバッファーで精製量を比較しました。

実験条件

サンプル：DDDDK-tagged GFP 10 μg/ sample
ゲル： DDDDK-tagged PROTEIN PURIFICATION GEL（Code No.3328）、A社ゲルを各10 μL（ゲル容量）使用
溶出：DDDDK-tag peptide（Code No.3325-205）20 μL×2回
溶出後サンプルを各20 μL泳動

DDDDKタグ融合β-Galactosidaseタンパク質の精製

DDDDK-tagged PROTEIN PURIFICATION GEL（Code No.3328）とA社精製ゲルを用いて、3種類のバッファーで精製量を比較しました。

実験条件

サンプル：DDDDK-tagged β-galactosidase/ 293T TF cell lysate (2x10⁶ cells/sample)
ゲル： DDDDK-tagged PROTEIN PURIFICATION GEL（Code No.3329）、A社ゲルを各10 μL（ゲル容量）使用
溶出：DDDDK-tag peptide（Code No.3325-205）20 μL×2回
溶出後サンプルを各20 μL泳動

DDDDK-tagged PROTEIN PURIFICATION GEL（Code No. 3328）を用いてDDDDKタグ融合GFPタンパク質（DDDDK-GFP）の精製・溶出を行った後、ゲル再生バッファーにてゲルの再生を行いました。このゲルを用いて同様にDDDDK-GFPの精製・溶出を行い、この操作を10回繰り返しました。

精製したDDDDKタグ融合GFPタンパク質の量比較

溶出液40 μL中、20 μLを12.5％アクリルアミドゲルで電気泳動し、クマシー染色を行いました。
再利用10回目でも1回目と同量のタンパクを回収できています。

DDDDK-tagged PROTEIN PURIFICATION GEL（Code No.3328）を用いて1 mM DTTまたは10 mM 2-メルカプトエタノール（2-ME）存在下でタンパク質精製を行った後、ゲル再生バッファーにてゲルの再生を行いました。このゲルを用いて同様にDDDDK-GFPタンパク質の精製・溶出を行い、この操作を10回繰り返しました。

精製したDDDDKタグ融合GFPタンパク質の量比較

溶出液40 μL中、10 μLを12.5％アクリルアミドゲルで電気泳動し、クマシー染色を行いました。
10 mM DTT、10 mM 2-MEいずれの還元条件下でも、再利用10回目で1回目と同量のタンパク質を回収できました。

10 mM DTTを含有した結合液、洗浄液、溶出液を使用

10 mM 2-MEを含有した結合液、洗浄液、溶出液を使用

DDDDK-tagged PROTEIN PURIFICATION GEL（Code No.3328）をグリシンバッファー（pH3.0）と混合して15、30、45、60分インキュベートした後、DDDDKタグ融合GFPタンパク質（DDDDK-GFP）の精製・溶出を行った時の精製量を比較検討しました。

精製したDDDDKタグ融合GFPタンパク質の量比較

溶出液40 μL中、20 μLを12.5％アクリルアミドゲルで電気泳動し、クマシー染色を行いました。
pH3.0のバッファーに60分放置したゲルでも、pH3.0未処理のゲルと同量のタンパクを回収できました。