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Image based Protein-Protein interaction (PPI) analysis

  • 生きた細胞で、リアルタイムにタンパク質間相互作用を観察できます。
  • 従来法に比べ、系の構築が簡単です。
  • 反応が可逆的で阻害剤のスクリーニングに最適です。
Fluoppiとは Fluoppiの原理 実験系の構築
Fluoppi使用例 細胞内の局在 PPI modulator [induction] PPI modulator [inhibition]
参考文献



第一三共RDノバーレ株式会社からFluoppiを使った論文が発表されました！

FluoopiがTPD(Target Protein Degradation)分野において、PROTACなどのタンパク質分解誘導試薬の評価に有用であることが示されています。
Kaji T, et al., Characterization of cereblon-dependent targeted protein degrader by visualizing the spatiotemporal ternary complex formation in cells. Sci Rep.10, Article Number: 3088 (2020) [PMID: 32080280]

A*STAR p53 Laboratoryと共同でFluoppiを使った論文を発表しました！

P53とMDM2、MDM4の相互作用を同時にマルチカラーで検出する方法が紹介されています。この系を使って、生きた細胞内でペプチド医薬品候補化合物の評価を行っています。
Frosi Y, et al., Simultaneous measurement of p53:Mdm2 and p53:Mdm4 protein-protein interactions in whole cells using fluorescence labelled foci. Sci Rep. 9, Article Number: 17933 (2019) [PMID: 31784573]

パーキンエルマージャパンのアプリケーションノートでFluoppiが紹介されました !

これより外部のウェブサイトに移動します。（よろしければここをクリックしてください。）

理化学研究所 宮脇敦史チームと共同で、Fluoppiの原理や開発過程についての論文を発表しました！

生きた細胞でタンパク質間相互作用（PPI）を可視化するFluoppi技術のベースとなるデータや応用例が多数掲載されています。ぜひご一読ください！
Watanabe T, et al., Genetic visualization of protein interactions harnessing liquid phase transitions. Sci Rep. 7, Article number: 46380 (2017) [PMID: 28406179]

Fluoppiとは

概要

Fluoppi (Fluorescent based technology detecting Protein-Protein Interactions) は、生きた細胞内でタンパク質間相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）を測定するための新しい基盤技術です。 Fluoppiは全く別の視点から蛍光タンパク質を利用した技術であり、PPIを細胞内の蛍光輝点(Puncta)として検出します。PPIの存在を示すPunctaはPPIが発生した場所で直ちに形成され、PPIの解離とともに分散します。 Fluoppiの最大の特徴は系の構築が簡便であり、また、得られるシグナルが明瞭である点です。特殊な装置を必要とせず、蛍光顕微鏡さえあればPPIを検出することができるため、イメージングを専門とする研究者以外の方々にも幅広くご利用頂けます。

PPI induction PPI inhibition
mTOR(FRB) and FKBP12 p53 and MDM2

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Fluoppiの原理


Fluoppi（フロッピー）はTag-technologyです。4量体形成能を有する蛍光タンパク質（FP-tag）と、多量体形成能を有するAssembly Helper Tag (Ash-Tag)から構成されます。蛍光相関分光法による測定で、Ash-Tagは希薄溶液中において平均的に4から8量体を形成することがわかっています。それぞれのtagに相互作用を検出したいタンパク質XとYを遺伝的に融合します。
タンパク質XとYの相互作用が無い場合、両者は分散して存在します。XとYが相互作用すると、Fluoppiのtagを融合したタンパク質同士が局所的に集まります。Tagの一方は蛍光タンパク質の為、顕微鏡下では蛍光性の輝点（Puncta）として観察されます。


■イメージ図


実験系の構築

■ベクターマップ

■蛍光特性


 励起最大波長/蛍光最大波長 モル吸光係数 (M-1cm-1) 量子収率 pH感受性
AG
492/505
72,300 (492 nm)
 0.67 pKa=5.0

■ワークフロー
1. Target gene amplification & restriction enzyme cut

Fluoppiの系を構築するためにはまず、タンパク質X/Yに各tagを融合したプラスミドを作製します。 最適な組み合わせを選択する為に、融合位置（N・C末）と融合するtag（FP-tag or Ash-tag）の違いにより、合計で8通りのプラスミドを作製することをお勧めします。


2. Ligation & sequencing

3. Transfection
作製したプラスミドをtransfectionします。


4. imaging
得られるシグナルが明瞭であるため、特殊な装置を必要とせず、蛍光顕微鏡さえあればPPIを検出することができます。

種々の刺激によりタンパク質X/Yが相互作用すると、Punctaが形成されます。一方、タンパク質X/Yが相互作用しない場合、蛍光は分散した状態で観察されます。


■p53-MDM2の相互作用の検討例

p53-MDM2の相互作用について、全てのバリエーションを検討しました。上段と中段の写真は8通りの組み合わせの検討結果、下段は、ネガティブコントロールとしてAsh-Tagのみをco-transfectionした結果です。この様に、様々な蛍光パターンが得られることがあるため、全ての組み合わせを試し、最適な組み合わせを選択する事をお勧めします。これまで検討したPPIでは8通りを検討するだけで多くの場合でPPIを検出できています。


Fluoppi使用例

細胞内の局在


FP-tag, Ash-tag自身は、細胞内の特定の領域に局在しません。このため、 Fluoppiは複数の細胞内領域において、タンパク質間相互作用を検出する事ができます。


PPI modulator [induction]

■mTOR(FRB domain)とFKBP12のRapamycin依存的な相互作用のモニター例

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mTOR(FRB domain)のC末にhAG(Humanized Azami Green)を融合し、FKBP12のN末にAsh-Tagを融合しました。Rapamycin添加前（左）は蛍光が分散して観察されますが、Rapamycin添加後（右）数分で相互作用を示すPunctaが徐々に形成されます。



左のグラフはRapamycin濃度依存的なPuncta形成の検出、右はFK506によるRapamycin競合阻害を示しています。Rapamycinを添加し、60分後に細胞を固定しました。観察は、ORCA-ER (Hamamatsu photonics)、IX71 fluorescence microscopy (Olympus)を使用し、ICY platform (Institut Pasteur)、 IGOR software (HULINKS Inc.)によって解析しています。


PPI modulator [inhibition]

■p53-MDM2相互作用に体するPPI inhibitor効果の検出例

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p53-MDM2はタンパク質間相互作用阻害剤 (PPI inhibitor)の分野でよく知られた創薬ターゲットです。種々のがんではMDM2の発現量が高く、p53によるアポトーシスの誘導を阻害していることが知られています。
p53-MDM2をFluoppiに適用し、まず、最適な組み合わせを8通りから選択し、G418とHygromycinを用いてCHO-K1安定発現株を作製しました。
写真はNutlin-3（20 µM）添加後、継時的にPunctaが消失する様子を示します。数分でPunctaが解離する様子が観察されました。
写真右下の時間は、分：秒を示します。



Nutlin-3濃度依存的にPunctaが消失する様子を検出した結果です。各濃度のNutlin-3を添加し、30分後細胞を固定しました。In Cell Analyzer 1000（GE Healthcare）によりPunctaの蛍光輝度を測定した結果、IC50は6.3 µMと算出されました。




p62-Keap1-Nrf2 経路のタンパク質間相互作用検出

p62-Keap1-Nrf2経路 Keap1とNrf2のPPI（タンパク質間相互作用）は、細胞の様々なストレス応答のトリガーとなる非常に重要なタンパク質間相互作用です。近年の研究により、このKeap1-Nrf2相互作用がオートファジー関連因子p62のリン酸化を介して制御されていることが示されました1）。
p62がリン酸化されると、p62とKeap1との親和性が増し、Nrf2がKeap1から離れて核に移行できるようになります（p62-Keap1-Nrf2経路）。この結果、ストレス応答転写因子として知られるNrf2は様々なストレス耐性遺伝子の発現を亢進させます。
今回、弊社独自の技術であるFluoppiを用いて、Keap1とNrf2のPPIを可視化することができました。Keap1抗体を用いてマウス細胞画分を解析した結果では、Keap１は主に核近傍の細胞質（81％）と小胞体（14％）および核（5％）に存在することが報告されています2）。

1) Ichimura Y, et al., Phosphorylation of p62 activates the Keap1-Nrf2 pathway during selective autophagy. Molecular Cell. 51, 618-631 (2013) [PMID: 24011591]
2) Watai Y, et al., Subcellular localization and cytoplasmic complex status of endogenous Keap1. Genes Cells. 12, 1163-1178 (2007) [PMID: 17903176]

Fluoppiを用いたKeap1とNrf2のPPI（AG-Nrf2とAsh-Keap1ベクター）
　　Azami Green（蛍光タンパク質）側にNrf2を、Ash-Tag側にKeap1を融合させたベクターをそれぞれ構築し、
　　transientにHT1080細胞に発現させた。核の周辺部に、Punctaを確認した。
　　データのご提供：筑波大学医学医療系 実験病理学 鈴木 裕之 先生


使用文献

  • Koyano F, et al., Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510, 162-166 (2014) [PMID: 24784582]
  • Yamano K, et al., Site-specific Interaction Mapping of Phosphorylated Ubiquitin to Uncover Parkin Activation. J Biol Chem. 290, 25199-211 (2015) [PMID: 26260794]
  • Asamitsu K, et al., Quantification of the HIV transcriptional activator complex in live cells by image-based protein-protein interaction analysis. Genes Cells. 21, 706-16 (2016) [PMID: 27193293]
  • Watanabe T, et al., Genetic visualization of protein interactions harnessing liquid phase transitions. Sci Rep. 7, Article number: 46380 (2017) [PMID: 28406179 ]
  • Frosi Y, et al., Simultaneous measurement of p53:Mdm2 and p53:Mdm4 protein-protein interactions in whole cells using fluorescence labelled foci. Sci Rep. 9, Article Number: 17933 (2019) [PMID: 31784573]
  • Kaji T, et al., Characterization of cereblon-dependent targeted protein degrader by visualizing the spatiotemporal ternary complex formation in cells. Sci Rep.10, Article Number: 3088 (2020) [PMID: 32080280]

参考文献

  • Saio T, et al., PCS-based structure determination of protein-protein complexes. J. Biomol. NMR. 46, 271-280 (2010) [PMID: 20300805]
  • Banaszynski LA, et al., Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J. Am. Chem. Soc. 127, 4715-21. (2005) [PMID: 15796538]
  • Vassilev LT, et al., In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303, 844-848. (2004) [PMID: 14704432]