RIP-Chip解析（RIP-Assay Kit）

mRNAには、通常、RNA結合タンパク質（RBP）が結合してリボヌクレオプロテイン（RNP）と呼ばれる複合体として存在しています。RBPはRNAに結合してRNAを分解から守り、転写後から翻訳までの様々な過程を制御することで転写後の遺伝子発現調節に関与しています。これまでの研究から、mRNAがRBPによって発現調節を受けるとき、RBPは機能的に関連するmRNAに選択的に結合し、それらを集めてクラスター(RiboCluster）を作り、mRNAの発現を時空間的に調和的に制御していることがわかってきました。
RIP-Assayは、RBPに対する抗体を用いてRNPを免疫沈降後、RNP中のRNAを回収する手法です。RIP-Assayにより得られたRNAについて、マイクロアレイや次世代シークエンサーで解析することで、特定のRBPに結合するRNAのポピュレーションを解析することができます。Whole transcriptome解析と異なり、特定のRBPに結合するRNAを解析することで、これまで得られなかった知見が得られる可能性があります。RIP-Assayと網羅的解析を組み合わせることで、治療医薬のターゲットになり得るような新しい分子を探索することができます。

Rapamycin （一般名：Sirolimus）は、免疫抑制剤や抗癌剤として臨床の場で使用されていて、mTOR経路を阻害します。EIF4Eは、mTOR経路の下流に位置するRNA結合タンパク質です。mTORが活性化しているときは、リン酸化した4EBP1から離れてmRNAの5’-capや翻訳開始因子と結合してリボソームなどの翻訳装置を呼び込む役割を担っています。Rapamycin処理により、EIF4Eは4EBP1と結合したままで、mRNAの5'-capへの結合が抑制されるため、翻訳が抑制されます。RIP-Chip解析（RIP-Assayで得られたRNAのマイクロアレイ解析）により、ラパマイシンの標的分子を探索しました。

緑の点で示した遺伝子群は、Rapamycin処理によりmRNAの発現量自体に変化は生じませんが、eIF4EとmRNAの5’-cap結合効率が低下しています。すなわち、薬剤処理によりこれらのmRNAの翻訳効率が低下していることを意味し、転写レベルではなく翻訳レベルでタンパク質の発現量が調節されている可能性を示唆しています。
また、RBPは機能的に関連性のある遺伝子群をクラスターを介して制御していると考えられていますが、その考えを裏付けるように一連のファミリー遺伝子が同様の発現プロファイルを示しました。
この様に、RIP-Chip法を用いることで、従来の手法では見いだせなかった事象を網羅的に解析することが可能になります。

図. Rapamycin添加によるmRNA結合状態変化（アレイデータ）
左はtotal RNA、右はEIF4E RIPにより得られたmRNAのアレイ解析データ（スキャッタープロット）です。
縦軸にRapamycinを添加したサンプル、横軸はmockをとり、Rapamycin添加による発現変動および結合量の変化を表しています。スキャッタープロット中に示した緑の点のGene 4, 5, 12G, 12Iは、total RNAでは、Rapamycinを添加しても発現量は変化しませんでした。 EIF4E-RIPでは、 Rapamycinの添加により2倍以上の結合量の変化が認められました。