トップ > 学ぶ・調べる > 実験の原理と方法 > ELISAの原理と方法

ELISAの原理と方法

ELISA法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay;イライザ、エライザ、あるいはエライサと呼びます)は、試料溶液中に含まれる目的の抗原あるいは抗体を、特異抗体あるいは抗原で捕捉するとともに、酵素反応を利用して検出・定量する方法です。

原理

ELISA ~96ウェルプレートでの実施例種々の抗原抗体反応の組合せを利用し、最終的には酵素標識した抗原あるいは抗体を反応系に組込んで、酵素活性を検出します。
酵素活性の検出には、反応によって吸光スペクトルが変化する基質が用いられ、吸光度測定で数値化します。
抗原抗体反応の組合せによって直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法などと呼ばれる方法があります。


① 直接法

ELISA 直接法
マイクロプレートに目的タンパク質(あるいは目的抗体)を固相化し、酵素標識した目的タンパク質に対する抗体(あるいは目的抗体が特異結合する抗原)を反応させ、洗浄後、マイクロプレートに残る酵素活性を検出します。


② 間接法

ELISA 間接法
マイクロプレートに目的タンパク質を固相化し、目的タンパク質に対する抗体、続けてその抗体に対する酵素標識された二次抗体を反応させ、洗浄後、マイクロプレートに残る酵素活性を検出します。
直接法に比べて間接法は反応工程が多く必要になりますが、二次抗体(標識抗体)を市販品として購入することができるため、標識作業が不要になります。

脱パラ
 ELISAで使用できる二次抗体は [こちら]


③ サンドイッチ法

swELISA
マイクロプレートに目的タンパク質に対する抗体を固相化し、目的タンパク質を反応させます。続いて酵素標識した目的タンパク質に対する別の抗体を反応させ、洗浄後、マイクロプレートに残る酵素活性を検出します。
この時、固相化した抗体(橙)と酵素標識抗体(緑)の抗原認識部位は異なっている必要があります。

AZ's point
抗原エピトープの異なる2つの抗体の組み合わせを上手く選択することにより、反応の特異性が直接法よりも高くなります。
サンドイッチ法は高い検出精度を求められる場合に有効な方法です。



④ 競合法

ELISA 競合法
マイクロプレートに目的タンパク質に対する抗体を固相化し、目的タンパク質および濃度があらかじめ分かっている酵素標識抗原を、同一マイクロプレート内で同時に反応させます。
反応後、マイクロプレートに残る酵素活性を検出します。

試料中に含まれる抗原が多い場合は、抗体と結合できる酵素標識抗原が減少し、発色が弱くなります。逆に試料中の抗原が少ない場合は、抗体と結合できる酵素標識抗原が増加し、発色が強くなるので、試料中の抗原と吸光度の関係は右上のグラフのようになります。

AZ's point
標的の抗原が小さいと、サンドイッチ法では抗体のほうが大きすぎて2つの抗体の間に挟むことが出来ない場合があります。例えば、ヒスタミン、農薬、ダイオキシンなどです。
競合法はこのような低分子の測定において威力を発揮します。



プレートへの抗体・抗原の固相

どんな力で結合(吸着)しているのか?

疎水的相互作用あるいは共有結合による固相化が一般的です。
それぞれにふさわしい表面加工が施されたマイクロプレートが市販されています。どちらの原理で固相化を試みるかについては、固相化するタンパク質によります。一般的に、より小さなペプチドなどは共有結合による固相化が選択され、大きなタンパク質などは疎水的相互作用による固相化(いわゆる物理吸着)が選択されますが、各測定系によりどちらが適切か検討する必要があります。


プレート表面の加工

ELISA用プレートには疎水タイプ、親水タイプやアミノ基、カルボキシル基など共有結合させる場合に有用な加工がされたものなど多くの種類が販売されています。
ELISA用プレートの種類は結合目的に応じて正しく選択することが重要です。



方法

ELISA(サンドイッチ法) ※MBLでの一例です。
作業内容

> 試薬・器具の準備

ELISA 器具

> 抗体の固相化

ELISA用の96ウェルプレートの各ウェルに抗体希釈液を加え、溶液が蒸発してしまわないようシールして、4℃で15-18時間静置し、抗体を固相化します。

> 洗浄

抗体希釈液を除き、洗浄液で3回洗浄します。

> ブロッキング

マイクロプレート内への目的タンパク質の非特異的結合を低減するためにブロッキングバッファーを各ウェルに加え、37℃で1時間静置します。

ELISA 分注

> 洗浄

ブロッキングバッファーを除き、洗浄液で3回洗浄します。

> 検体の添加

検体を検体希釈液で希釈し、100 µLずつ各ウェルに加えます。検量線作成用の標準物質の希釈列も作製します。
37℃で1時間静置します。

> 洗浄

検体を除き、洗浄液で5回洗浄します。

> 検出抗体の添加

検出用抗体を検体希釈液で希釈し、100 µLずつ各ウェルに加えます。
37℃で1時間静置します。

ELISA 分注

> 洗浄

反応後、検出用抗体を除き、洗浄液で5回洗浄します。

> 酵素標識二次抗体の添加

酵素標識二次抗体を検体希釈液で希釈し、100 µLずつ各ウェルに加えます。
37℃で1時間静置します。

ELISA 分注

> 洗浄

反応後、二次抗体を除き、洗浄液で5回洗浄します。

> 基質溶液を添加します。

> 発色の程度を見ながら静置します。

> 十分発色したら反応停止液を添加し、反応を止めます。

> ELISAプレートリーダーで吸光度(波長450 nm)を測定します。












関連リンク