タグ融合タンパク質精製キット
- 目的のタグ融合タンパク質が回収できません。
精製前のサンプル中にタグ融合タンパク質が存在する事がウエスタンブロット等の検討により明らかであるにもかかわらず、目的のタグ融合タンパク質が本キットを用いて精製できなかった場合は、実験に用いたtag ビーズにSDS-PAGE サンプルバッファーを直接加え、5分間煮沸処理後SDS-PAGE またはWB にて解析して下さい。その結果、目的のサイズにバンドが確認できない場合はA-2 を、バンドが確認できた場合はA-3 をご参照下さい。 - 目的のタグ融合タンパク質がビーズに吸着しません。
タグ融合タンパク質がビーズに吸着しない場合には、次のような原因が考えられます。
本キットはビーズに抗タグ抗体を結合させておりますので、不溶性のタグ融合タンパク質や、アグリゲートしているタグ融合タンパク質は抗タグビーズに結合しない場合があります。また、本キットはグアニジンおよび高濃度のUrea を含むバッファーは使用できません。製品プロトコールの最終ページに細胞溶解バッファー試薬の使用可否を添付しておりますのでご参照下さい。タグとタンパク質との相性により、タグ融合タンパク質の可溶性が変化する場合もありますので、タグの位置や種類を変えることもご検討下さい。 - 抗タグビーズにタグ融合タンパク質は結合するのですが、ペプチド溶出バッファーを加えてもタグ融合タンパク質が溶出されません。
タグ融合タンパク質が溶出されない場合には、ペプチド溶液を添加後のインキュベート時間を長くするか、ペプチドの添加量を増やしてみて下さい。
アグリゲートしやすいタグ融合タンパク質の場合は、ゲルに目的タグ融合タンパク質が結合した状態でアグリゲートし、溶出できない場合があります。そのようなサンプルの場合はバッファーの組成を変更するなど、タグ融合タンパク質をアグリゲートさせない条件での精製を行って下さい。（例; 添付の洗浄バッファーに替えて細胞溶解バッファーをゲルの洗浄バッファーとして用いるなど。）バッファーの組成を変更する場合には、製品データシートの最終ページにバッファー試薬の使用可否を添付しておりますのでご参照下さい。
まずはTrial サイズのキットで検討されることをおすすめします。 - 使用できる細胞溶解バッファーの種類は？
製品データシートの最終ページに試薬の使用可否を添付しておりますのでご参照下さい。NP-40 Lysis buffer、Tween Lysis buffer のように一般的な界面活性剤を含むバッファー、0.1％ SDS を含有するRIPA buffer は使用可能です。 - 精製する際にタグの位置は関係しますか？
MBLの精製キットはタグの位置を選びません。
N末とC末の2箇所にタグの付いたタンパク質も精製できています。 - ペプチド溶出の時の温度を室温ではなく4℃で行いたいのですが？
His タグ以外のタグ精製キットでは十分溶出可能です。
His タグの精製キットでは、溶出を4℃で行った場合、溶出効率は室温の場合に比較して1/2以下になります。室温での溶出をおすすめします。
（4℃での溶出が必要な場合はペプチド溶出液を加えて抗His ビーズを一晩インキュベートしてから溶出して下さい。） - 大腸菌に発現させたタグ融合タンパク質をインクルージョンボディーから精製できますか？
タグ融合タンパク質精製キットは抗タグ抗体をビーズに結合させているので、高濃度のUreaや、グアニジンなどの試薬は使用できません。また、不溶性のタグ融合タンパク質はカラムに結合しませんので使用できません。 試薬耐性については、製品データシートの最終ページをご参照下さい。 - ペプチド溶出液以外のバッファーでタグ融合タンパク質の溶出は可能ですか？
SDS-PAGEサンプルバッファーや、酸性バッファー（0.1M Glycine-HCl pH2.3～3.0で溶出後、1M Tris pH8.0で中和）、アルカリバッファー（0.1M アンモニア水 pH11.3で溶出、1N 酢酸で中和）などの溶出が可能です。そのようなバッファーで溶出した場合、精製は可能ですがタグ融合タンパク質の活性は失われる恐れがあります。