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RIP-Assay Kit for microRNA

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  1. RIP-Assay Kit for microRNAとRIP-Assay Kit との違いは何ですか?
    RIP-Assay Kitではsmall RNAを回収できません。
    RIP-Assay Kit for microRNAはsmall RNAとlarge RNAの両方を回収することができます。さらに、small RNA と large RNA を別々もしくは small RNA だけを回収することもできます。RBP/large RNAに結合するsmall RNAを回収することで、対象とする細胞内イベントがRBPだけでなくsmall RNAによってどのように調節されているかも調べられます。さらに、miRNAのターゲット同定にも有用です。
  2. 実験で必要な細胞数はどのくらいですか?
    細胞の種類によって異なりますが、4×106 -2×107個の細胞を準備してください。はじめは、目安として1×107 cells/sampleでの検討をお勧めします。
  3. 最も効率よくmiRNAを得られる抽出方法を教えてください。
    large RNAが混入しても問題なければ、2-step methodで抽出してください。ロスを最小限に抑えられます。 large RNAの混入を避けたい場合は、Separation method もしくは 1-step methodで抽出してください。
  4. 得られたmiRNAの測定方法を教えてください。
    回収したmiRNAの量や質を確認したい場合は、変性ゲルでの電気泳動後、Gelstar(タカラバイオ; code. F0535)などの核酸検出試薬や銀染色により可視化して、目的のサイズのmiRNAが回収できたか、分解産物を多く含んでいないか、また、コントロールとの比較で回収量を確認してください。定量レンジであれば、RNA定量試薬による定量も可能です。
    回収したmiRNAのうち、特定のmiRNAの有無または得られた量を知りたい場合は、Northern blotまたはRT-PCRで確認することができます。網羅的に解析する場合は、RT-PCR、マイクロアレイ、シークエンスを行うことで、得られたmiRNAを同定することができます。
  5. ゲル抽出以外に、miRNAを単離する方法はありますか?
    miRNAの使用目的によりますが、
    ・アレイの場合、溶出液をそのまま使用可能です。
    ・クローニングやシークエンスに使用する場合、on beadsでリンカーを付加させた後にmiRNAを回収します。
    ・small RNA Cloning Kit (タカラバイオ; code. RR065)などのキットもあります。
  6. RNA回収の確認にバイオアナライザーと銀染色を両方行っているのはどうしてですか?
    RIP-Assay Kit for microRNAでは、large RNAとsmall RNAを両方回収可能です。 バイオアナライザーは、RIP後に得られたlarge RNAについてRNAが分解していないか、各RBPごとに特徴的なRNAが得られているか確認する目的でおこなっています。各RBPの波形のパターンを見て、対象とするRBPに特徴的なRNAを回収できたか確認する目安としています。 銀染色は、small RNAの回収を確認する目的で行っています。small RNAの場合、NanoDropやバイオアナライザーの検出限界以下となってしまうためです。
  7. クロスリンクをおこなわず、Protease inhibitorの添加のみでRNAは安定化しますか?
    protease inhibitorの添加は、RBPや抗体の分解を防ぐことを目的としており、RNA-RBPの結合の安定化への効果は少ないと考えられます。RBPとの結合力が弱いRNAを回収したい場合はクロスリンクが必要となります。
  8. (ホルマリン)クロスリンクしてもRIP抗体で抽出できますか?
    ホルマリンでのクロスリンクは検討しておりません。 ホルマリンでは核酸とタンパク質だけでなく、タンパク質同士も架橋されます。したがって、クロスリンク検討を実施するにあたり、ホルマリンはあまり適さないと判断しています。
  9. 営利企業が使用する場合、ライセンス契約等が必要になりますか?
    RIP-Assay KitやRIP-Chip技術を事業目的で使う場合はライセンス契約が必要です。詳細は弊社にお問い合わせください。→ お問い合わせフォームへ