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MethylHunter MBD1-based DNA Enrichment Kit ver. 1, ver. 2

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ver.2 関連ご質問



ver.1, ver.2 共通ご質問-ご回答

  1. MBD1の特徴は何ですか?
    MBD1 (Methyl-CpG-binding domain protein 1) はN末端側のメチル化CpG結合ドメイン(MBD)を介してフルメチルCpGに特異的に結合するタンパク質です。MBDファミリータンパク質にはMBD1, MBD2, MBD3, MBD4, MeCP2があり、MBD3以外はメチル化DNA結合能を有することが知られています。
  2. MBD1とMBD2の違いは何ですか?
    MBDファミリータンパク質のうち、特にMBD1とMBD2はメチル化CpGに特異的に結合する性質があるためメチル化CpG濃縮に利用されます。社内検討では、MBD1はMBD2と比較してメチル化CpGに対する特異性の高さを示す結果が得られています。
    → 詳細はこちらをご覧ください。
  3. キット付属のMBD1の由来は何ですか?
    ヒトMBD1の一部にHis-tagを融合させたリコンビナントタンパク質です。
  4. 植物サンプルで使用可能ですか?
    フルメチル化CpGのPull downであれば、サンプルの由来に関わらず使用可能です。 ただし、ヘミメチル化CpGや、植物でみられるCpG以外のメチル化(CpHpG、CpHpH)のPull downには使用できません。
  5. InputにはどのくらいのDNAが必要ですか?
    サンプルによりますが、付属のゲノムDNAでは収量はinput DNA 1µgに対して40 ng~60 ng (4~6%)程度となっています。Pull down後の解析に必要な量から逆算してご検討下さい。
  6. コントロールDNAとプライマーの由来を教えてください。
    コントロールDNAはC57BL/6J 成体 オス肝臓由来です。プライマーは以下の領域に設計しています。
    Positive Control Primers: chr7:135,456,098-135,456,204
    Negative Control Primers: chr18:29,316,335-29,316,489
  7. 付属のプライマーはサンプルに関わらずコントロールとして使用可能ですか?
    Positive Control PrimersはC57BL/6J 成体 オス肝臓由来、Negative Control PrimersはC57BL/6JのゲノムDNAをサンプルとして使用する場合は使用可能です。それ以外は、使用するサンプルごとにポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとなる領域を確認していただく必要があります。

ver.2 関連ご質問-ご回答

  1. Pull down産物はシーケンス解析に使用可能ですか?
    可能です。ver.2に含まれるSolution IVは共沈剤を含みますが、シーケンスの前処理には影響しません。
  2. キットを用いて回収したDNAについてqRT-PCRにて解析する予定です。Input DNAの使用量を教えてください。
    キット構成品のControl Genomic DNAとPositive Control Primersを用いたReal-time PCRでは、1 ng以上のinput DNAでメチル化DNAの濃縮を確認できています。
    → 詳細はこちらをご覧ください。
  3. プロトコールの反応時間は短縮できますか?
    反応時間の短縮はおすすめしません。MBD1とDNAの反応時間を半分の1時間とすると収量が70%程度にまで低下することを確認しています。なお、反応温度を室温で行うと反応時間に関わらず収量が半減するため、4℃での反応をおすすめします。
    → 詳細はこちらをご覧ください。
  4. プロトコールの反応時間を伸ばすことで収量を増加させることはできますか?
    プロトコールの反応時間(2時間+2時間)を伸ばしてもメチル化DNAの収量に変化はありません。 また、MBD1とDNAを混合する段階でAnti-His-tag mAb-Magnetic beadsも加え、overnightで反応させることは可能ですが、収量は同程度となります。