His tagged Protein PURIFICATION KIT
- 目的Hisタグタンパク質が回収できないのですが？
- 目的Hisタグタンパク質がビーズに吸着しないのですが？
- 抗HisビーズにHis tagタンパク質は結合するのですが、ペプチド溶出バッファーを加えてもHis tagタンパク質が溶出されないのですが？
- 使用できる細胞溶解バッファーの種類は？
- 精製する際にHis tag の位置は関係しますか？
- ペプチド溶出の時の温度を室温ではなく4℃で行いたいのですが？
- 大腸菌に発現させたHis tagタンパク質をインクルージョンボディーから精製できますか？
- 精製法が２種類ありますが、プロトコール(1)と、プロトコール(2)はどのようなときに使い分ければよいでしょうか？
- ペプチド溶出液以外のバッファーでHis tagタンパク質の溶出は可能ですか？
- 目的Hisタグタンパク質が回収できないのですが？
精製前のサンプル中にHisタグタンパク質が存在する事がウエスタンブロット等の検討により明らかであるにもかかわらず、目的のHisタグタンパク質が本キットを用いて精製できなかった場合は、実験に用いたHis tagビーズにSDS-PAGEサンプルバッファーを直接加え、５分間煮沸処理後SDS-PAGEまたはWBにて解析して下さい。その結果、目的のサイズにバンドが確認できない場合はA−2を、バンドが確認できた場合はA−3をご参照下さい。 - 目的Hisタグタンパク質がビーズに吸着しないのですが？
次のような原因が考えられます。
本キットはビーズに抗His tag抗体を結合させておりますので、不溶性のHis tagタンパク質や、アグリゲートしているHis tagタンパク質は抗His tagビーズに結合しない場合があります。また、本キットはグアニジンおよび高濃度のUreaを含むバッファーは使用できません。製品プロトコールの最終ページに細胞溶解バッファー試薬の使用可否を添付しておりますのでご参照下さい。 - 抗HisビーズにHis tagタンパク質は結合するのですが、ペプチド溶出バッファーを加えてもHis tagタンパク質が溶出されないのですが？
次のような原因が考えられます。
本キットではHis tagタンパク質の溶出にはペプチド溶出バッファーを加えて室温で30分間インキュベートする必要があります。4℃でのインキュベートや、インキュベート時間が短いと溶出効率が低下します。4℃で溶出する際はペプチド溶液を添加後、一晩インキュベートしてください。
また、アグリゲートしやすいHis tagタンパク質の場合、ゲルに目的His tagタンパク質が結合した状態でアグリゲートし、溶出できない場合があります。そのようなサンプルの場合はHis tagタンパク質をアグリゲートさせない条件での精製を行ってください。（例; 添付の洗浄バッファーに替えて細胞溶解バッファーをゲルの洗浄バッファーとして用いるなど。）
まずはTrial サイズのキット（Code No. 3310A）で検討されることをおすすめします。 - 使用できる細胞溶解バッファーの種類は？
製品データシートの最終ページに試薬の使用可否を添付しておりますのでご参照ください。NP-40 Lysis buffer、Tween Lysis bufferのように一般的な界面活性剤を含むbuffer、0.1％ SDSを含有するRIPA bufferは使用可能です。 - 精製する際にHis tag の位置は関係しますか？
His tagの位置はどこであっても精製できます。
N末とC末の2箇所にHis tagの付いたタンパク質も精製できています。 - ペプチド溶出の時の温度を室温ではなく4℃で行いたいのですが？
溶出を4℃で行った場合、溶出効率は室温の場合に比較して1/2以下になります。室温での溶出をおすすめします。（4℃での溶出が必要な場合はペプチド溶出液を加えて抗Hisビーズを一晩インキュベートしてから溶出してください。） - 大腸菌に発現させたHis tagタンパク質をインクルージョンボディーから精製できますか？
本キットは抗His抗体をカラムに結合させたビーズを用いておりますので、高濃度のUreaや、グアニジンなどの試薬は使用できません。また、不溶性のHis tagタンパク質はカラムに結合しませんので使用できません。 - 精製法が２種類ありますが、プロトコール(1)と、プロトコール(2)はどのようなときに使い分ければよいでしょうか？
1 μg以下の場合はプロトコール(2)での精製をおすすめします。 - ペプチド溶出液以外のバッファーでHis tagタンパク質の溶出は可能ですか？
SDS-PAGEサンプルバッファーや、酸性バッファー（0.1M Glycine-HCl pH2.3〜3.0で溶出後、1M Tris pH8.0で中和）、アルカリバッファー（0.1Mアンモニア水 pH11.3で溶出、1N酢酸で中和）などの溶出が可能です。そのようなバッファーで溶出した場合、精製は可能ですがHis tagタンパク質の活性は失われます。