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RiboCluster Profiler™


RiboTrap Kit

製品詳細 

~RNAをbaitにRNPクラスターを網羅的に解析するツール~

  • RNAのスプライシング、核外輸送、細胞質内局在、安定性及び翻訳など、転写後の遺伝子発現調節の研究に!
  • Small RNAの生合成研究やnon-coding RNAの研究に!
  • 新規RBPの発見に!
BrU標識RNAを用いて、それに結合するRNP (リボヌクレオタンパク質)を回収することにより、RiboCluster構成因子を網羅的に解析することができるキットです!

原理

RiboTrap原理

RiboTrapは、ある特定の遺伝子に興味がある場合、そのRNAの転写後制御に関連するタンパク質を同定する技術です。 T7プロモーターを付加したcDNAをテンプレートとして、5-Bromo-UTP (BrUTP)がランダムに取り込まれるようにin vitro transcription反応を行うことで、BrU標識RNAを合成します。 BrU-RNAに抗BrdU抗体結合ビーズを反応させた後に、細胞抽出液を加えてBrU-RNA-RBP複合体を形成させBrdUによる競合溶出により回収します。このRNP複合体をSDS-PAGEで分離・展開後、LC-MS/MS による分析を行うことにより、BrU標識RNAに特異的に結合するRBPを同定します。 本キットでは、RNP複合体の精製過程に最適化された洗浄バッファーを3種類準備しており、実験にあわせて洗浄条件を選択することができます。



RiboTrap Kitの特徴

製品詳細
  • RNAの標識にBrUTPを採用。さらにBrU-RNAの回収に適した高品質の抗BrdU抗体を同梱。
  • 実験にあわせて3種類のWash条件から最適な条件を選択可能。
     Wash Buffer I : mildな洗浄 (基本組成)
     Wash Buffer II : stringentな洗浄 (イオン強度を改変)
     Wash Buffer III : stringentな洗浄 (強力な界面活性剤を使用)
  • 細胞質画分/核画分を分けて調製することで、両画分のRNP構成因子を解析可能。
  • 溶出過程において、酸などの変性剤を使用することなくRNPを回収するため、様々な実験に応用可能。

RiboTrapキット写真 →RiboTrap Kit (Code No. RN1011) 製品詳細情報









RiboTrap Kitを用いたRBPの解析例
(洗浄条件:Wash Buffer I )

 



HEK293T細胞の細胞質画分とBrU標識したp21 mRNA の3’UTRを用いて得られた1~3のバンドをLC-MS/MSにて解析した結果、IGF2BP1/IMP1、PCBP2、HuRが同定されました。 またこれらのタンパク質はWBでも確認されました。さらに1~3以外のいくつかのバンドも同様に解析したところ、 p21 mRNAの3’UTRに結合する可能性のあるRBPが複数確認されました。