LC3-IIは隔離膜やオートファゴソーム膜に局在していますが、単純にLC3-IIのバンドの増加のみでオートファジー誘導の有無を決定することはできません。
リソソーム阻害剤の処理を行ったサンプルと比較することで下記のようにオートファジーの誘導を判断できるようになります。
参考文献:Mizushima N, Yoshimori T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3, 542-5 (2007) (PMID: 17611390)
製品名 | クローン | アイソタイプ | 包装 | 使用法 | 交差性 |
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Anti-LC3 mAb-HRP-DirecT | 8E10 | Mo IgG2aκ | 100 µL | WB | Hu, Mo, Rat, Hm |
Anti-LC3 mAb | 4E12 | Mo IgG1κ | 50 µL, 2mg/mL | WB(weak), IC, IP, FCM, Immuno-EM | Hu, Mo, Rat, Hm |
Anti-α-Tubulin pAb-HRP-DirecT | Polyclonal | Rab IgG(aff.) | 100 µL | WB Positive Control | Hu, Mo, Rat, Hm,Chi |
Positive control for anti-LC3 antibody | 100 µL (20 tests) | ||||
Chloroquine solution (x1000) | 100 µL | ||||
Bafilomycin A1 solution (x1000) | 100 µL | ||||
Cell lysis buffer (x5) | 1 mL x2 |
使用法の表記について: WB: Western Blotting, IH: Immunohistochemistry, IC: Immunocytochemistry, IP: Immunoprecipitation, FCM: Flow Cytometry 交差性の表記について: Hu: Human, Mo: Mouse, Rab: Rabbit, Hm: Hamster, Chi: Chicken
飢餓処理により、栄養状態に比べてLC3-IIの増加が見られます(Lane1,2)。
飢餓処理に加え、培地中にChloroquine, Bafilomycin A1を加えるとLC3-IIがさらに増加することから(Lane3,4)、飢餓処理によるオートファゴソーム形成が促進されていることがわかります。
飢餓条件のHBSSで培養するとオートファゴソームがドット状に観察でき、阻害剤を添加することでオートファゴソームが増加しているのがわかります。