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Autophagy Watch
for Autophagy Flux Assay and LC3 Immunostaining


特徴

  1. 抗LC3抗体とオートファジー経路の阻害剤がセットになっており、これらを用いてウエスタンブロッティング(WB)を行うことでオートファジー誘導の有無を調べるオートファジーフラックスアッセイができます。

  2. WB用抗体はHRPを直接標識した製品で、2次抗体を必要としないため、アッセイ時間の短縮2次抗体由来の非特異反応がなくなるといった長所があります。

  3. オートファジー経路の阻害剤にはリソソーム阻害剤であるChloroquineとBafilomycin A1が同梱されています。培地で1,000倍希釈をするだけで使えます。

  4. 細胞染色用抗体がキットに含まれています。蛍光標識2次抗体による細胞染色により、細胞内のオートファゴソームを可視化して観察することができます。

オートファジーフラックスアッセイとは?

LC3-IIは隔離膜やオートファゴソーム膜に局在していますが、単純にLC3-IIのバンドの増加のみでオートファジー誘導の有無を決定することはできません。
リソソーム阻害剤の処理を行ったサンプルと比較することで下記のようにオートファジーの誘導を判断できるようになります。

オートファジーフラックスアッセイオートファジー誘導の解釈

参考文献:Mizushima N, Yoshimori T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy 3 (6) : 542-5. (2007) (PMID: 17611390)

キット構成品

製品名 クローン アイソタイプ 包装 使用法 交差性
Anti-LC3 mAb-HRP-DirecT 8E10 Mo IgG2aκ 50 µL WB Hu, Mo, Rat, Hm
Anti-LC3 mAb 4E12 Mo IgG1κ 50 µL, 2mg/mL WB(weak), IC, IP, FCM, Immuno-EM Hu, Mo, Rat, Hm
Anti-α-Tubulin pAb-HRP-DirecT Polyclonal Rab IgG(aff.) 50 µL WB Positive Control Hu, Mo, Rat, Hm,Chi
Positive control for anti-LC3 antibody 100 µL (20 tests)
Chloroquine solution (x1000) 100 µL
Bafilomycin A1 solution (x1000) 100 µL
Cell lysis buffer (x5) 1 mL x2

使用法の表記について: WB: Western Blotting, IH: Immunohistochemistry, IC: Immunocytochemistry, IP: Immunoprecipitation, FCM: Flow Cytometry 交差性の表記について: Hu: Human, Mo: Mouse, Rab: Rabbit, Hm: Hamster, Chi: Chicken



Autophagy Watch を用いたオートファジー検出例:WB


飢餓処理により、栄養状態に比べてLC3-IIの増加が見られます(Lane1,2)。
飢餓処理に加え、培地中にChloroquine,  Bafilomycin A1を加えるとLC3-IIがさらに増加することから(Lane3,4)、飢餓処理によるオートファゴソーム形成が促進されていることがわかります。


Autophagy Watch を用いたオートファジー検出例:IC


飢餓条件のHBSSで培養するとオートファゴソームがドット状に観察でき、阻害剤を添加することでオートファゴソームが増加しているのがわかります。


Autophagy Watch(Code No. 8486) 製品情報を見る→