Quant Tetramer Kit スターターガイド

● 製品ラインナップ ● キット構成 ● 必要な試薬・装置 ● ワークフロー図 ● プロトコル  A.ペプチド交換ステップ  B.フローサイトメトリーによるペプチド交換効率の測定 ● ペプチド交換効率算出法

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製品名	Code No.
	PE標識	APC標識	BV421標識
QuickSwitch™ Quant HLA-A*01:01 Tetramer Kit	TB-7308-K1	TB-7308-K2	TB-7308-K4
QuickSwitch™ Quant HLA-A*02:01 Tetramer Kit	TB-7300-K1	TB-7300-K2	―
QuickSwitch™ Quant HLA-A*03:01 Tetramer Kit	TB-7306-K1	TB-7306-K2	TB-7306-K4
QuickSwitch™ Quant HLA-A*11:01 Tetramer Kit	TB-7304-K1	TB-7304-K2	TB-7304-K4
QuickSwitch™ Quant HLA-A*24:02 Tetramer Kit	TB-7302-K1	―	TB-7302-K4
QuickSwitch™ Quant H-2Kb Tetramer Kit	TB-7400-K1	TB-7400-K2	TB-7400-K4

構成品名		用途	容量	保存温度
QuickSwitch™ Tetramer		Exiting Peptide搭載テトラマー	500 μL	2-8℃
Peptide Exchange Factor		ペプチド交換因子	13 μL	-20℃以下
Magnetic Capture Beads		抗テトラマー抗体結合磁性粒子	500 μL	2-8℃
Exiting Peptide Antibody-FITC (25x)		ペプチド交換測定用試薬 （Exiting Peptideを認識する抗体）	25 μL	2-8℃
Reference Peptide 1 mM		ポジティブコントロールペプチド	13 μL	-20℃以下
Assay Buffer (10x)		洗浄/希釈バッファー	1.7 mL	2-8℃

■ペプチド（交換用）商品一覧はこちら           ■フローサイトメーター

■マグネットプレート                  ■ボルテックスミキサー

■マイクロチューブ                   ■丸底もしくはコニカル底 96ウェルマイクロプレート

■マイクロピペットとディスポーザブルチップ       ■アルミホイル

■超純水                        ■DMSO

■プレートシェイカー（Labline model 4625もしくは同等品）

■ウォーターバスソニケーター（Branson Ultrasonic Cleaner Model #B200 もしくは同等品）

ご使用の際の注意

1. ご使用前に必ずReference PeptideとAssay Buffer（10x）を室温（20～25℃）に戻してください。
2. Assay Buffer（10x）を2-8℃に保存した場合、沈殿物や混濁物が認められる場合があります。その際は、ご使用前に30℃で数分間インキュベーションし、溶解してください。
3. 希釈した試薬（1x Assay Buffer、1x Exiting Peptide Antibody-FITC）は、調製した日にご使用してください。
4. QuickSwitch™ TetramerとExiting Peptide Antibody-FITCは遮光した状態で実験作業や保管をしてください。
5. クロスコンタミネーションがおこらない様に注意して、実験作業をしてください。
6. 試薬にはアジ化ナトリウム（≦0.09%）を防腐剤として含有しています。皮膚等に付着した場合、多量の水で洗い流してください。そして、直ちに医師に連絡してください。
7. マグネットプレートが無い場合には、プレートローター遠心機をご使用ください。

A ペプチド交換ステップ

B フローサイトメトリーによるペプチド交換効率の測定

A ペプチド交換ステップ

１ 交換するペプチドをDMSOで10 mMに調製します。
（高アフィニティーのペプチドの場合、1 ｍMに調製して使用することが可能です。）

２ 50 μLのQuickSwitch™ Tetramerをマイクロチューブに分注します。

３ ステップ１で用意した1 μLのペプチド溶液を加え、ピペッティングで混合します。

４ 1 μLのPeptide Exchange Factorを加え、ピペッティングで混合します。

５ 他にも交換をするペプチドがあれば、ステップ１～４を繰り返してサンプルを用意します。

６ Reference Peptide用のサンプルを用意します。
　50 μLのQuickSwitch™ Tetramerをマイクロチューブに分注します。
　1 μLのReference Peptide 1 ｍMを添加し、ピペッティングで混合します。
　続けて、1 μL のPeptide Exchange Factorを加え、ピペッティングで混合します。

７ 遮光して、室温にて4時間以上*インキュベーションします。
（*製品により反応時間が異なります。詳しくはデータシートをご覧ください。）

８ その後、遮光した状態で、2～8℃に保管します。

B フローサイトメトリーによるペプチド交換効率の測定

フローサイトメーターを用いて、各ペプチドの交換効率を測定します。コントロールサンプルを下図の様に用意して、測定解析を行います。データ取得後、QuickSwitch™ Calculatorを用いて、ペプチド交換効率を計算します。 QuickSwitch™ Calculatorはこちらからダウンロード可能です。
( http://www.mblintl.com/quickswitch-peptide-exchange-calculator/)

Control #3 ：ペプチド交換を行わないサンプルです。FITC標識抗体が、Exiting Peptideを認識します。
Reference Peptide：100％のペプチド交換効率だった場合を想定しています。この場合、FITC標識抗体は、Reference Peptideを認識しません。
User’s Peptide ：ユーザーが準備したペプチドです。上図では50%の交換が起こった場合を想定しています。

1x Assay Bufferの準備

１ 1x Assay Bufferの調製をします。
・1～5種類のペプチド交換の場合：１つのチューブに750 μLの10x Assay Bufferを加え、続けて6.75 mLの超純水を加えます。
・6～8種類のペプチドの場合：上記の液量を2倍にして調製します。

Capture Beadsの分注

２ 使用する前にTetramer Capture Beadsのチューブを30秒間、ウォーターバスソニケーターもしくはボルテックスミキサーで撹拌します。ウォーターバスソニケーターが無い場合、ボルテックスミキサーで30秒間、追加撹拌します。
３ 丸底もしくはコニカル底 96ウェルマイクロプレートを用意します。
４ 20 μLのTetramer Capture Beadsをウェル 1～7に分注します。
コントロール3種とReference Peptide（ポジティブコントロール）の他、「Aペプチド交換ステップ」で用意したテトラマーの数に合わせてウェルを用意し、分注してください。
ここではUser's Peptideが3種類のケースを想定しています。

テトラマー結合Capture Beadsの作製

５ 5 μLの1x Assay Bufferをウェル 2に分注します。

６ 5 μLのQuickSwitch™ Tetramerをウェル 1とウェル 3に分注します。

７ 「Aペプチド交換ステップ」で用意した5 μLのテトラマーをウェル 4～7に分注します。

８ アルミホイル等で遮光後、マイクロプレートをプレートシェイカーに設置して、550 rpmで45分間撹拌します。

Rinse

９ 150 μLの1x Assay Bufferをウェル 1～7に分注します。

10 マイクロプレートをマグネットプレートにセットし、5分間静置します。※

11 クロスコンタミネーションに注意して、上清を捨てます。

12 マグネットプレートにマイクロプレートをセットした状態で2秒間、ボルテックスミキサーで撹拌し、その後、マグネットプレートからマイクロプレートを外します。

※マグネットプレートが無い場合には、プレートローター遠心機を用いて、1,000 x gで5分間遠心してください。

Preparation of 1x Exiting Peptide Antibody

13 Exiting Peptide Antibody-FITC（25x）から1xの調製の為、「サンプル数」を確認します。
「サンプル数」は、コントロール用で2種類とReference Peptide（ポジティブコントロールペプチド）で1種類、
「A ペプチド交換ステップ」で用意したテトラマーの種類を合計した数になります。
マイクロチューブを用意し、（「サンプル数」＋1）x 24 μLの1x Assay Bufferを加え、続けて（「サンプル数」＋1）x 1 μLのExiting Peptide Antibody-FITC（25x）を加えます。
ピペッティングで混合し、1x Exiting Peptide Antibody-FITCを用意します。

Beads incubation with Exiting Peptide Antibody

14 ステップ13で用意した1x Exiting Peptide Antibody-FITCをウェル 2～7に25 μLずつ分注します。

15 25 μLの1x Assay Bufferをウェル 1に分注します。

16 アルミホイル等で遮光後、マイクロプレートをプレートシェイカーに設置して、550 rpmで45分間撹拌します。

Rinse

17 150 μLの1x Assay Bufferをウェル 1～7に分注します。

18 マイクロプレートをマグネットプレートにセットし、5分間静置します。※

19 クロスコンタミネーションに注意して、上清を捨てます。

20 マグネットプレートにマイクロプレートをセットした状態で2秒間、ボルテックスミキサーで撹拌し、その後、マグネットプレートからマイクロプレートを外します。

21 200 μLの1x Assay bufferをウェル 1～7に添加し、混合します。

※マグネットプレートが無い場合には、プレートローター遠心機を用いて、1,000 x gで5分間遠心してください。

１ ウェル Xに200 μLの1x Assay Bufferを加え、続けて5 μLのMagnetic Capture Beadsを加え、混合します。

以上でフローサイトメトリー解析用サンプルの準備は完了です。

詳細については製品添付のデータシートをご確認ください。